內蒙古氨基嘧啶廠家，苦木主要活性成分4,5-二甲氧基—鐵屎米酮的體內外代謝及其機制實驗研究：

中藥苦木Picrasma quassiodes(D.Don)Benn.民間多用于治療腸胃炎,毒蛇咬傷,感染和高血壓,是許多中藥制劑(如苦木注射液、苦木合劑、苦木片,等)的重要組成成分,臨床上用于治療胃腸炎、細菌性痢疾、高血壓、感冒、上呼吸道感染、急性扁桃體炎及各種急性感染性疾病?，F代藥理研究表明,4,5-二甲氧基-鐵屎米酮作為苦木的主要活性成分之一,具有抗炎、抗癌、抑制cAMP活性、降壓、抗病毒等多種藥理作用。相比于其較廣泛的藥理作用研究而言,關于4,5-二甲氧基-鐵屎米酮藥代動力學的研究卻鮮有報道。本文應用高分辨、高靈敏液質聯用技術(如UPLC-Q-TOF-MS/MS和UPLC-MS/MS技術),對4,5-二甲氧基-鐵屎米酮體內外藥動學進行了如下研究:1.4,5-二甲氧基-鐵屎米酮的體內外代謝物鑒定研究利用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術,研究了 4,5-二甲氧基-鐵屎米酮在不同種屬(人、狗、大鼠及小鼠)肝微粒中的代謝物種類與含量,以及SD大鼠肌肉注射4,5-二甲氧基-鐵屎米酮后血漿與尿液中的代謝物種類與含量。結果表明:①4,5-二甲氧基-鐵屎米酮分別經4種屬肝微粒體溫孵50 min后,在大鼠和小鼠肝微粒體中檢測到了 8個原藥的Ⅰ相代謝產物,包括2個去甲基化代謝產物M1和M2,3個羥基化代謝代謝產物M3、M4和M5,3個去甲基化及羥基化的代謝產物M6、M7和M8。在人和狗肝微粒體中檢測到了除M7之外的其它7個原藥Ⅰ相代謝產物。②大鼠肌肉注射給藥(200 μg/kg)后,在血漿中檢測到3個Ⅰ相代謝產物(M1、M2和M5),在尿液中檢測到5個Ⅰ相代謝產物(M1-M5),且在血漿和尿液中均沒有檢測到原藥的Ⅱ相代謝產物。③體外肝微粒體代謝產物中,去甲基化代謝產物M1和M2是4,5-二甲氧基-鐵屎米酮的主要代謝物,羥基化代謝產物M3-M5是其次要代謝物。體內代謝與體外代謝具有一定程度的相似性,即甲基化代謝為主,羥基化代謝為輔。內蒙古嘧啶2.4,5-二甲氧基-鐵屎米酮的體外代謝酶鑒定研究在鑒定了體外代謝物的基礎上,選用9個人源性CYP450亞酶化學抑制劑(CYP1A2/α-奈黃酮、內蒙古氨基嘧啶CYP2C9/氟康唑、CYP2C19/噻氯匹定、CYP2D6/奎尼丁、CYP2E1/二烯丙基二硫、CYP3A4/酮康唑、CYP2A6/甲氧沙林、CYP2C8/吡格列酮和CYP2B6/氯吡格雷),分別與原藥4,5-二甲氧基-鐵屎米酮在人肝微粒體中進行體外溫孵反應,并應用UPLC-MS/MS技術檢測各代謝物的生成量篩選參與原藥代謝的CYP450亞酶,再通過人重組CYP450亞酶體外代謝實驗確定人肝微粒體中參與原藥代謝的酶。結果表明,人肝微粒體中CYP3A4參與了原藥代謝物M1-M5的生成,CYP2C9參與了代謝物M1-M3和M6-M8的生成,CYP2D6參與了代謝物M3的生成。3.4,5-二甲氧基-鐵屎米酮體外對人CYP450酶活性的影響以人肝微粒體為酶源,非那西丁(CYP1A2)、安非他酮(CYP2B6)、甲苯磺丁脲(CYP2C9)、右美沙芬(CYP2D6)、氯唑沙宗(CYP2E1)、睪酮(CYP3A4)、香豆素(CYP2A6)和紫杉酚(CYP2C8)為CYP450亞酶的探針底物,通過4,5-二甲氧基-鐵屎米酮與探針底物在人肝微粒體中的溫孵反應,檢測各探針底物代謝物的生成量,考察原藥對各代謝酶活性的體外影響。結果表明,4,5-二甲氧基-鐵屎米酮體外對其它CYP450亞酶活性沒有明顯影響,但可以反競爭性抑制人CYP1A2介導的非那西丁 O-去乙基化反應,半數抑制濃度(IC50)和抑制常數(Ki)分別為1.7 μM和2.6 μM。原藥對人CYP1A2活性的較強抑制作用提示,臨床上當CYP1A2底物藥物與4,5-二甲氧基-鐵屎米酮或含4,5-二甲氧基-鐵屎米酮中藥聯合用藥時,可能存在藥物代謝相互作用風險。4.4,5-二甲氧基-鐵屎米酮及其代謝物在大鼠體內的藥動學研究以3-甲基鐵屎米-2,6-二酮為內標,甲醇沉淀蛋白為血漿樣品前處理方法、乙酸乙酯萃取為組織樣品前處理方法,建立了一種用于血漿和組織樣品中4,5-二甲氧基-鐵屎米酮及其代謝物M1(5-羥基-4-甲氧基鐵屎米酮)和M2(M1的同分異構體)含量測定的UPLC-MS/MS方法,并將該法用于研究原藥肌肉注射給藥后它們在大鼠體內的藥動學和組織分布。色譜條件:C18色譜柱(2.0mm×150mm,4.6μm),0.1%甲酸水(A)-甲醇(B)混合液為流動相。0-14.0 min,保持40%B;14.01-19.0 min,40%B線性增加到85%B;19.01-24.0 min,繼續保持40%B平衡色譜柱;流速:0.4 mL/min;柱溫:40℃;進樣體積:10 μL。質譜條件:在ESI正離子多反應離子檢測(MRM)模式下,用于定量檢測的離子對分別是m/z281.0→167.1(4,5-二甲氧基-鐵屎米酮)、m/z267.0→168.1(M1和M2)和m/z251.0→195.1(內標)。該方法用于定量分析的靈敏度、精密度、準確度、穩定性、內蒙古玉嘧磺胺基質效應與回收率結果均符合FDA規定的體內樣品分析要求。大鼠單次肌肉注射4,5-二甲氧基-鐵屎米酮后的藥動學研究結果表明:肌肉注射給藥后,4,5-二甲氧基-鐵屎米酮體內吸收快速(Tmax=5.4-6.4 min),且消除速度也較快(t1/2z=64.9-77.7 min);隨著給藥劑量的增大,4,5-二甲氧基-鐵屎米酮的AUC0-t和Cmax增加,t1/2z保持不變,說明4,5-二甲氧基-鐵屎米酮的體內藥動學符合一級動力學特征。與原藥的AUC0-t比較,代謝物M1的只有原藥的15.2-19.9%,而代謝產物M2的則是原藥的194.1-218.4%,說明M2是原藥體內的主要代謝物。組織分布結果顯示,4,5-二甲氧基-鐵屎米酮在檢測的組織中分布速度快、范圍廣,給藥64 min后在組織中就檢測不到原藥,說明其在組織中的消除也很快。此外,原藥在肝臟組織中分布最多,在其它組織中的分布沒有明顯差別;且代謝物M1、M2只在肝臟中能被檢測到。上述研究結果對深入了解中藥苦木主要活性成分4,5-二甲氧基-鐵屎米酮的體內代謝轉化與分布,代謝相互作用,內蒙古氨基嘧啶以及基于苦木生物堿的新藥開發與臨床合理用藥,均具有積極作用。