水產品中三類內蒙古氨基嘧啶重要化學殘留物快速檢測方法的研究：

水產養殖業近年來蓬勃發展,但同時面臨著國際貿易技術壁壘的不斷增強以及國內由于藥物濫用而導致的各類水產品安全問題的巨大挑戰。內蒙古氨基嘧啶“打鐵還要自身硬”。最徹底的解決辦法還是建立合適的檢測方法和監管體系加以防范,從根本上杜絕隱患。氯霉素、孔雀石綠、磺胺二甲基嘧啶和磺胺二甲氧嘧啶作為水產品中殘留問題較為突出的藥物,建立更加嚴格的篩查辦法已勢在必行。酶聯免疫分析法和側流免疫分析法用于檢測這三大類化學殘留物具有便捷快速,高效穩定等特點,適合水產品殘留的現場檢測。本課題從高效抗原的合成和篩選著手,經過細胞融合后,進一步篩查制備單克隆抗體,并開發相應的快速檢測方法。首先從特征性功能基團著手,通過混合酸酐法和碳二亞胺法等方法,以不同的摩爾反應比合成多種氯霉素抗原,經過紫外和凝膠電泳法鑒定后免疫動物,通過ELISA檢測篩選免疫效果好的免疫原、對應的檢測抗原和免疫小鼠。經過細胞融合和亞克隆,篩選出超靈敏的抗氯霉素單克隆抗體6F11。內蒙古嘧啶通過對主要影響因素的優化,確定了工作條件為:以CAP-OVA作為檢測抗原,以0.01mol/L p H 6.5的PBS溶液稀釋后進行包被,實驗過程中調節洗液和抗體稀釋液的p H至7.0,顯色時間為15 min。在優化條件下,ic-ELISA方法的IC50為0.010 ng/m L,線性范圍(IC20~IC80)為0.003 ng/m L~0.040ng/m L。其對氯霉素三種結構類似物(FFC、FFA和TAP)都沒有交叉反應。通過牛奶陰性樣本的添加回收實驗,ic-ELISA方法的回收率在98.9%~106.8%之間,變異系數小于10%。為節約大批量樣本的現場檢測時間,研究并建立了一步法檢測的標準曲線,單抗的IC50為0.025 ng/m L,線性范圍為0.009 ng/m L~0.067 ng/m L。內蒙古氨基嘧啶基于側流免疫原理建立了氯霉素金標試紙條,金標抗體的工作條件為:1 m L膠體金溶液中,0.1mol/L K2CO3添加量為4?L,氯霉素單抗添加量為15?g,NC膜上包被氯霉素檢測抗原CAP-BSA濃度為0.8 mg/m L。優化并檢測了牛奶中的氯霉素殘留,裸眼觀察判斷檢測限為0.3 ng/m L,用T線的顏色深度值建立標準曲線的檢測限為0.263ng/m L,線性范圍為0.116 ng/m L~0.596 ng/m L。金標試紙條與ic-ELISA法檢測結果相一致,可以滿足牛奶中氯霉素殘留的檢測要求。檢測魚肉中的氯霉素殘留,裸眼觀察判斷檢測限為0.2 ng/g,檢測靈敏度可達到0.1 ng/g,該方法也適于水產品中氯霉素殘留的現場快速篩查。以同樣的思路制備了高靈敏的抗孔雀石綠單克隆抗體2E10,并建立了魚肉中孔雀石綠殘留的ic-ELISA檢測方法。通過對主要影響因素的優化,確定了工作條件為:以CEO50作為檢測抗原,以0.01mol/L p H 6.5的PBS溶液稀釋后進行包被,實驗過程中調節洗液和抗體稀釋液的p H至5.0,顯色時間15 min。在此條件下,ic-ELISA方法的IC50值為0.057 ng/m L,線性范圍為0.02 ng/m L~0.162 ng/m L。其對結晶紫的交叉反應率為90.4%,與其他三苯甲烷類物質沒有交叉反應。通過魚肉樣本的添加回收實驗,此方法的回收率在98.5%~116.3%之間,變異系數小于10%。基于側流免疫原理建立了孔雀石綠金標試紙條,金標抗體的工作條件為:1 m L 30 nm膠體金使用濃度為5 nmol/L,酶標二抗添加濃度為0.3 mg/m L,抗體添加濃度為0.2mg/m L,NC膜上包被4.5 mg/m L的檢測抗原(CEB30)。通過添加回收建立魚肉中三苯甲烷類物質殘留的檢測方法,孔雀石綠總量和結晶紫總量的IC50分別為0.418 ng/g和0.532 ng/g,與孔雀石綠其他類似物無交叉反應。應用于水產品陽性樣本檢測,確定孔雀石綠的殘留量為195 ng/g樣本,實驗重復性較好。內蒙古玉嘧磺胺篩選高效的完全抗原,進而制備高靈敏的抗磺胺二甲基嘧啶單克隆抗體10D6,建立ic-ELISA法檢測的IC50值為0.221 ng/m L,線性范圍為0.074 ng/m L~0.667 ng/m L,將此方法應用于魚肉中添加回收實驗,平均回收率為79.6%~108.6%,變異系數小于10%。篩選高效的完全抗原,進而制備高靈敏的抗磺胺二甲基嘧啶單克隆抗體6C11,優化實驗條件后,所建立ic-ELISA法檢測的IC50值為0.419 ng/m L,線性范圍為0.158ng/m L~1.110 ng/m L將此方法應用于魚肉中添加回收實驗,內蒙古氨基嘧啶平均回收率為96.3%~128.1%,變異系數小于10%,表明此方法檢測水產品中藥物殘留的可行性。