內蒙古嘧啶發現其激酶選擇性很差,從化合物5與JAK1的共晶結構(圖4)可以看出,化合物5的氨基嘧啶部分與鉸鏈區形成氫鍵,吲哚上的NH和酰胺Linker與Asp1021的羧酸側鏈形成氫鍵,并且觀察到了吡啶與His885的咪唑側鏈之間的相互作用,這一相互作用穩定了P環,使得P環區能夠觀察到清晰的電子密度。5的吡唑環側鏈占據由Phe958、Pro960、Ser961和Gly962形成的小的疏水口袋,而這個小的疏水口袋在JAK2中是由Tyr931、Pro933、Tyr834和Gly934形成的。JAK2中的這個口袋對于取代基的空間要求更高,吡唑環上的甲氧基在其中的耐受性差,從而導致對JAK2的活性降低,提高了化合物對JAK1的選擇性。作者為了提高化合物的激酶選擇性重新合成了300多個6的酰胺類似物,發現化合物9具有中等的JAK1活性和良好的選擇性、水溶性以及穩定性。在化合9與JAK1的共晶結構(圖5)中可以看到,吲哚上的NH和酰胺Linker與JAK1的Asp1021氫鍵相互作用是不變的,有趣的是,手性哌嗪部分和Asp1003之間的鹽橋作用也很明顯,雖然P環周圍的電子密度很明顯,但由于該區域缺乏芳香環,配體不能與殘基形成直接的π?π相互作用,所以推測化合物9良好的選擇性是疏水相互作用,氫鍵以及環丙酰胺部分共同發揮作用的結果。在9的基礎上對Linker和哌嗪取代基進一步探索,得到化合物10-14(表2),發現其活性和選擇性都差于化合物9。
于是,在化合物9的基礎上,作者重新對嘧啶環2位上的取代基進行了改造。首先引入甲基吡啶取代基得到化合物15,發現其對于JAK1具有高度的選擇性,但是JAK1活性卻下降了,只有0.13 μM。將甲基換成較小的取代基氟以后,活性和選擇性都有改善,但是對于HERG離子通道有抑制作用(IC50=10 μM)。而引入2-甲氧基-1-甲基氨基吡唑形成化合物17,發現其活性和選擇性良好,對于HERG離子通道無抑制作用。(表3)
接下來,作者對嘧啶環5位上的取代基進行了探索,內蒙古嘧啶因為JAK1具有蛋氨酸守門殘基,因此,疏水取代基或氫可能在C-5位置上是有利的。如表4所示,取代基的疏水性增加導致JAK1活性更高(18、19和20的IC50分別為7、19和8 nM),然而,也觀察到JAK2活性具有相同的趨勢,并且18、19和20對于HERG離子通道也具有一定的抑制作用。總體而言,具有C5-H取代基的21表現出良好的JAK1活性、選擇性,并且沒有檢測到HERG活性。因此,作者選擇對它進行進一步的分析。
化合物21在不同物種的肝細胞中表現出較高的穩定性,溶解性和透膜性良好(表5)。具有良好的跨物種藥代動力學特性(表6),在大鼠體內清除率低(20mL/min/kg),半衰期適中(6h),口服生物利用度高。同樣觀察到21在犬體內的低清除率(9 mL/min/kg),長半衰期(9 h),高口服利用度(71)。
為了了解化合物21的抗腫瘤活性,在NCL-H1975小鼠模型中評價了21與EGFR第三代抑制劑osimertinib聯合治療時的療效(圖6)。在聯合治療組中,與單獨使用osimertinib(紅色)相比,聯合使用21增強了抗腫瘤活性(綠色),但是單獨使用21時的抗腫瘤活性較弱(藍色)。在治療的后一天,聯合用藥對腫瘤生長的抑制作用與單藥22相比具有更強的抗腫瘤活性。所有治療耐受性良好,在治療過程中沒有觀察到明顯的體重減輕。
從一個初篩得到的化合物3出發,通過基于結構的設計方法,得到了活性和選擇性都較高的先導化合物9,為了進一步提高活性和選擇性,通過繼續優化,發現了具有高度JAK1抑制活性和良好的DMPK特性的候選藥物21(AZD4205)。在臨床前NSCLC模型中,該化合物與批準的EGFR抑制劑osimertinib聯合使用顯示出增強的抗腫瘤活性,內蒙古嘧啶這些發現值得在臨床試驗中對化合物21開展進一步的研究。