內蒙古嘧啶胺目的:包括WZ4002,CO-1686和AZD9291在內的針對特定突變類型,不可逆的第三代EGFR-TKI對于發生吉非替尼/厄洛替尼耐藥突變T790M的肺癌患者及臨床前模型中是有效的。但是,目前關于腫瘤對于這類EGFR酪氨酸激酶抑制劑的獲得性耐藥進展的研究很少。為此,我們嘗試探尋研究和找出針對此類第三代EGFR-TKI的EGFR突變。
實驗設計:我們進行了針對EGFR突變(單獨敏感突變或伴隨T790M突變)的Ba/F3細胞的亞硝基乙基脲(NEU)誘變篩選并選擇出耐藥的克隆。我們評估了EGFR-TKI在伴隨耐藥突變的EGFR突變模型中的敏感性。
結論:我們發現了3種主要的藥物耐藥突變,EGFR L718Q,L844V和C797S突變都導致對WZ4002和CO-1686的耐藥。相比之下,只有C797S突變作用于AZD9291的耐藥機制。產生L718突變,L844V突變或C797S突變同時伴隨EGFR敏感突變(如19外顯子缺失或L858R突變)的細胞對于一代EGFR-TKI吉非替尼和厄洛替尼仍然敏感。存在19缺失/L858R加上T790M以及C797S突變的情況下對目前所有EGFR-TKI耐藥,但是L858R/T790M/C797S仍保留對Cetuximab的部分敏感。
總結:我們的發現提供了針對第三代EGFR-TKI耐藥機制的認識,并鑒定出對現有臨床EGFR-TKI仍然有效的特定基因組合。這些研究也許會對未來EGFR-TKI治療新策略的發展提供指導。
內蒙古嘧啶胺轉化醫學相關性:進行EGFR-TKI治療后,常見的獲得性耐藥的發生機制是T790M突變的出現。目前對此的治療策略包括嘧啶類針對特定突變的EGFR抑制劑,至今為止這些藥物可以使大部分由于發生T790M突變導致耐藥的肺癌患者腫瘤縮小。通過體外模擬藥物耐藥過程,我們發現導致針對化合物WZ4002以及臨床化合物AZD9291和CO-1686發生相關耐藥的EGFR突變。這些發現也許會幫助預測可能在臨床中出現的獲得性耐藥機制,以及用于潛在的以后可以在臨床中應用的治療策略研究。
鑒定出新的藥物耐藥位點:為了找出可能導致對WZ4002產生耐藥的突變位點, 我們使用了先前提到過的ENU誘導突變篩選法。將攜帶常見EGFR敏感突變(L858R and Del E746_A750)或伴隨T790M突變的Ba/F3細胞,在進行100 nmol/L或1 mmol/L濃度的WZ4002中進行ENU處理2周后選擇出耐藥的克隆。在四中不同的細胞株中發現了三種突變:
L718Q (codon 2153, T>A), L844V (codon 2530, C>G), 和C797S (codon 2389, T>A)
C797位點是和WZ4002共價結合的位點。若發生突變,則會導致藥物耐藥。L844V突變先前已經在一位非小細胞肺癌患者上被觀察到。 位于L718位點的L718P,L718V和L718M突變先前已被發現,但是EGFR L718Q并未發現過。這些突變目前的臨床意義還未明確。 我們接下來也驗證了是否L718Q 和 L844V突變是致癌性的突變并且導致了耐藥,抑或只是后者。T790M突變既是致癌突變同時又引起了對藥物的耐藥。 而EGFR L718Q 和 L844V 都不足以導致 IL3-獨立細胞在EGFR野生型背景的生長(圖1B)。有意思的是,雖然這些突變導致對WZ4002的耐藥,但是他們對不可逆的喹唑啉基EGFR抑制劑阿法替尼、neratinib和CL-387、785仍然敏感(如圖1C)。通過抑制EGFR磷酸化導致對這些Ba/F3細胞的生長抑制。吉非替尼作為一種可逆的喹唑啉基EGFR TKI,在L844V模型中有更好的療效 (圖1C)。但我們沒能在Del E746_A750 Ba/F3細胞中使用ENU誘導篩選方法鑒定出二重突變(圖1A)。處理過的EGFR Del E746_A750/L718Q而不是EGFR L858R/L718Q的Ba/F3細胞展示了一種生長劣勢,從而解釋了為什么這類突變沒有在以前的方法中被發現(圖1D)。內蒙古嘧啶胺在出現L718Q突變后,EGFR Del E746_A750細胞的EGFR磷酸化被抑制也支持了這個觀點。